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前言
在ELISA試劑盒的使用過程中，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。為了有效識別樣品配方與試劑盒組分之間的兼容性，加標(biāo)回收這一關(guān)鍵驗證試驗顯得尤為重要。它不僅是評估ELISA試劑盒準(zhǔn)確性的重要工具，也是滿足法規(guī)和藥典（如ICH或FDA指南等）對商品化ELISA試劑盒方法學(xué)驗證要求的可靠方式。
什么是加標(biāo)回收？
加標(biāo)回收就是將已知量的標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中（“加標(biāo)”，spiking），通過對比加入前后的檢測結(jié)果，評估“回收”（recovery）測量值的準(zhǔn)確性。這一過程可以揭示樣品及其緩沖液中某些成分是否會干擾檢測結(jié)果。目前，影響ELISA試劑盒定量結(jié)果的常見因素包括極端pH、去污劑、有機溶劑、高蛋白質(zhì)濃度以及高鹽濃度等。因此，在進行加標(biāo)回收實驗之前，確保排除這些干擾因素是至關(guān)重要的。
如何判定干擾因素？
樣品或緩沖液中的某些成分可能會影響HCP或其他雜質(zhì)的檢測與定量，導(dǎo)致回收結(jié)果的高估或低估，由此說明樣品中存在干擾因素。同樣，上游收獲物和過程樣品的基質(zhì)中也可能存在疑似干擾 ELISA 檢測的成分。
在有干擾的情況下，實驗結(jié)果通常表現(xiàn)為回收率偏低。但是，如果藥物本身或其他基質(zhì)組分與捕獲或檢測抗體有相互作用，則可能表現(xiàn)為回收率偏高。
此外，非特異性干擾，如試劑與孔板的結(jié)合，也會導(dǎo)致OD值偏高。通過合理控制實驗流程，可以找出具體的干擾因素。
何時進行加標(biāo)回收實驗？
在進行加標(biāo)回收實驗前，需要先完成樣品的稀釋線性分析，只有明確了最低需求稀釋倍數(shù)（MRD），加標(biāo)回收分析才有意義。（稀釋線性分析的詳細內(nèi)容請參考《HCP ELISA方法驗證——稀釋線性dilution linearity》）
（Tips：每種類型的樣品基質(zhì)都需要進行加標(biāo)回收分析。同時如果實驗步驟進行了優(yōu)化，則需要重復(fù)此實驗以確保檢測的有效性。）
如何執(zhí)行加標(biāo)回收分析？
樣品制備：
-
加標(biāo)樣品：可以設(shè)定3-4個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到不同類型待檢樣品中，制備成加標(biāo)樣品，需要注意的是加標(biāo)樣品的濃度需在滿足MRD的條件下進行分析，也就是最低加標(biāo)濃度不能低于LOQ的兩倍。
-
對照樣品：按相同體積比在每種待檢樣品中加入樣品稀釋液，制備成對照樣品，用于測定樣品本底的HCP濃度。
實驗過程：
使用ELISA試劑盒同時檢測加標(biāo)樣品和對照樣品，每個樣品最好做3個重復(fù)孔，以計算均值。
結(jié)果分析：
回收率計算公式：
如下表案例所示，我們使用大腸桿菌HCP ELISA試劑盒（F410）分別檢測加標(biāo)樣品（100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品與樣品按1:4體積比混合，加標(biāo)濃度為20 ng/mL）和對照樣品（樣品稀釋液與樣品按1:4體積比混合），通過測得的HCP濃度計算出回收率為95%。
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依據(jù)ICH、FDA及EMA等分析方法驗證指南要求，HCP加標(biāo)回收率的可接受范圍應(yīng)在75%~125%。
為了方便您快速了解如何用4倍稀釋法制備加標(biāo)樣品和ELISA布板的詳細步驟，請觀看以下操作視頻。
加標(biāo)回收問題排查
如果加標(biāo)回收數(shù)據(jù)顯示出明顯的產(chǎn)物或基質(zhì)干擾，您可能需要通過進一步稀釋樣品或置換緩沖液等方式來獲取準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。理想情況下，請選擇與標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液進行樣品稀釋，這樣可以最大限度地減少偏差。在某些情況下，調(diào)整檢測方法也許能提高特定樣品類型的準(zhǔn)確性，但請務(wù)必謹慎操作，以免影響結(jié)果的可靠性。
為了全力支持客戶進行加標(biāo)回收驗證及方法學(xué)開發(fā)，Cygnus為每款ELISA試劑盒都配備了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，詳情請查閱下表。
貨號
品名
規(guī)格
適用的試劑盒貨號
F553H-1
CHO
HCP Antigen Concentrate, 3G
400 μl
F550-1
F1048X
CHO Lysate HCP Antigen
Concentrate
200 uL
F1045
F1023X
E.
coli HCP 2G Antigen Concentrate
200 uL
F1020
F1063X
BL21(DE3) HCP Antigen
Concentrate
200 μl
F1060
F653SX
HEK
293 Antigen Concentrate
250 μl
F650S
F1043X
Sf9 HCP 3G Antigen
Concentrate
200 μl
F1040
F1018X
P.
pastoris HCP Antigen Concentrate
200 μl
F1015
F143U
P. pastoris Antigen
Concentrate
200 μl
F140/F640
F978X
Vero
Cell 2G HCP Antigen Concentrate
400 μl
F975
F1058X
PER.C6 HCP 2G Antigen
Concentrate
200 μl
F1055
F1033X
SP2/0
HCP 2G Antigen Concentrate
200 uL
F1030
F998X
PG13 HCP Antigen
Concentrate
200 uL
F995
F493G
L.
lactis HCP Antigen Concentrate
200 μl
F490
F233G
A549 Antigen Concentrate
200 μl
F230
F813X
HeLa
Antigen Concentrate
1 ml
F810
F803X
MDCK Antigen Concentrate
1 ml
F800
F513G
BHK
HCP Antigen Concentrate
1 ml
F510
F227C
NS/0 Antigen Concentrate
1 ml
F220
F453X
P.
fluorescens Antigen Concentrate
1 ml
F450
F823X
CAP® Antigen Concentrate
400 μl
F820
F1028X
C1
HCP Antigen Concentrate
200 uL
F1025
F603X
Protein A Antigen
Concentrate
250 μl
F600
F613X
Protein
A Antigen Concentrate
250 μl
F610
F403H
Protein A Antigen
Concentrate
200 μl
F400
F044
Protein
A Concentrate
200 μl
F050/F050H
F740-C
Amsphere? A3 Ligand Protein A Control
250 μl
F740
F968X
Avantor
J.T.Baker® BAKERBOND® PROchievA? Protein A Antigen Concentrate
250 μl
F965
F743X
Amsphere? A3 Ligand Protein A Antigen Concentrate
300 μl
F740
F1068X
Protein
L Antigen Concentrate
200 μl
F1065
F963X
EndonucleaseGTP® Antigen
Concentrate
500 μl
F960
F031G
BSA
Antigen Concentrate
1 ml
F030
雖然加標(biāo)回收可以驗證HCP ELISA的準(zhǔn)確性，但這只是整體方法學(xué)驗證的一部分。完整的驗證過程仍需包括精密度、LOD、LLOQ、ULOQ和HCP抗體覆蓋率等分析。Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應(yīng)的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點擊這里填寫信息索取，或直接聯(lián)系Cygnus中國總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過程中遇到任何問題，我們的技術(shù)支持團隊將竭誠為您提供解決方案和建議。
Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測超過50種不同表達系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測的高靈敏度分析技術(shù)的專家，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機構(gòu)的廣泛認可。
北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理，與國內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時間，降低QC成本。如您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站cmuyc.com了解更多信息。
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